Geruchsforschung als Millimeter-Arbeit


Wie schaffen es Taufliegen eigentlich, innerhalb kürzester Zeit eine Obstschale oder ein mit süffigem Rotwein gefülltes Glas ausfindig zu machen? Die Forscher um Bill Hansson am Max-Planck-Institut für chemische Ökologie in Jena wollen dem Geruchssystem der kleinen Fliege mit ausgefeilter Messtechnik auf die Spur kommen, dabei misst ihr Untersuchungsobjekt kaum mehr als einen halben Millimeter.

MaxPlanckForschung, S.25, 2, 2009

MPF0709 - Grundlagenforscher haben es nicht leicht: 1951, auf dem Treffen der Nobelpreisträger in Lindau, wollte die Gattin eines Wissenschaftlers von dem berühmten Pheromonforscher Adolf Butenandt wissen, wann man denn diese „sex attractive substances“ bekommen könne, an denen er arbeite. Butenandt erklärte ihr, dass er Pheromone von Schmetterlingen untersucht habe, und die Frau entgegnete enttäuscht: „Oh, Dr. Butenandt, why did you waste your time with butterflies?“ Was hätte die Dame wohl zu Bill Hansson gesagt?

Der Direktor der Abteilung für evolutionäre Neuroethologie in Jena „verschwendet“ seine Zeit nicht mit Faltern, sondern mit noch unscheinbareren Fliegen, die eine Vorliebe für vergammeltes Obst besitzen. Fruchtfliege, Taufliege oder Essigfliege – je nach dem, welcher Name geläufiger ist – heißen die zwei bis drei Millimeter großen Plagegeister, die jeder im Sommer in seiner Obstschale findet. Die Fliege, die gerne auch mal als Haustier der Laborforscher bezeichnet wird, ist wahrscheinlich das einzige Tier, dessen lateinischer Name so bekannt ist wie sein deutscher: Drosophila melanogaster. Bill Hansson, gebürtiger Schwede, untersucht seit neun Jahren den Geruchssinn des kleinen Insekts, seit 2006 am Max-Planck-Institut für chemische Ökologie in Jena.

Die Entscheidung für dieses Untersuchungsobjekt ist natürlich kein Zufall: „Kein Tier gibt uns so viele Möglichkeiten wie Drosophila“, sagt Hansson. Die Fliege lässt sich gentechnisch verändern und dabei wie ein Baukasten handhaben: „Man kann Steine wegnehmen, Steine umformen, einen roten Stein mit einem blauen Stein tauschen“, so der Max-Planck-Direktor etwas vereinfachend.

DUFTKOMPASS MIT KNUBBELIGEN RIECHORGANEN

Die Flexibilität ist nötig, denn Hansson und sein Team haben die Latte des Erfolgs hoch gelegt: „Wir wollen das Riechen bei Drosophila als Ganzes verstehen“, sagt Hansson mit leicht schwedischem Akzent, also den Geruchssinn des Insekts erforschen vom kleinsten Rezeptormolekül über die Verknüpfungen im Gehirn bis hin zum Verhalten, das die Fliege an den Tag legt, wenn sie Witterung aufgenommen hat. Die Forscher wollen jeden einzelnen Geruch auseinandernehmen und herausfinden, wie er auf das Tier wirkt. Dabei erscheint die Fliege auf den ersten Blick nicht gerade als das ideale Objekt, um den Geruchssinn zu erforschen, verglichen etwa mit dem Seidenspinner, dem klassischen Versuchstier in der Pheromonforschung.

Die Fliege ist kleiner, ihr Verhalten nicht so exaltiert wie das des Falters: „Wenn ein Falter-Männchen nur ein Molekül des Lockstoffs der Weibchen riecht, zack, geht es ab, alles andere ist dann egal“, sagt Hansson. Bei Drosophila sei das eher „unklar“. Was auch damit zu tun hat, dass Pheromone bei den Fliegen über große Distanzen keine Rolle spielen. Das sieht man auch den Riechorganen der beiden Arten an. Wie eine Kreuzung aus Farn und Geweih thronen bei den Faltermännchen die fein verästelten und – gemessenen an der Größe des Insekts – großflächigen Antennen am Kopf und repräsentieren eindrucksvoll, welche bedeutende Rolle der Geruch in ihrem Sexualleben spielt.

Bei Drosophila sind es zwei kleine konische Knubbel, die zwischen den vergleichsweise riesigen Facettenaugen sitzen. Der Begriff Riechkolben könnte treffender nicht sein. Etwas tiefer, oberhalb des Saugrüssels, sitzen zwei weitere kleine Knubbel, die Kiefertaster oder Maxillarpalpen, die ebenfalls dem Riechen dienen. Aus Antenne und Kiefertaster sprießen Hunderte von feinen Riechhaaren, die Sensillen. In diese muss ein Duftmolekül eindringen, um überhaupt erkannt zu werden. „Im Prinzip funktioniert jedes Riechhaar wie eine kleine Nase“, sagt Hansson. Über Poren – Insekten haben ein ansonsten nicht durchlässiges Außenskelett – tauchen die Duftmoleküle in eine proteinhaltige Lösung, die Sensillenlymphe ein. Dort werden die Moleküle von Duftstoffbindenden Proteinen in Empfang genommen, die sie zum Ziel ihrer Reise begleiten: den Geruchsrezeptoren.

STANDLEITUNG INS RIECHZENTRUM

Das Duftmolekül dockt an einen Rezeptor an, der auf einem der ein bis drei Dendriten sitzt, den verlängerten Armen einer Nervenzelle. Dort wird die Meldung „Duftmolekül angedockt“ in ein elektrisches Signal umgewandelt. Der Impuls wandert über die Standleitung der Nervenzelle, das Axon, direkt in das Riechzentrum der Fliege. „Genau wie bei uns und allen anderen Tieren sind die Geruchsrezeptoren die einzigen peripheren Rezeptoren, die ein Signal ohne Umwege ins Gehirn leiten“, sagt Hansson. Das Riechhirn der Fliege, der Antennallobus, ist aus vielen kugelförmigen Nervenknoten aufgebaut. Diese sogenannten Glomeruli sehen aus wie eine Ansammlung kleiner Ballons.

Jede der 1200 Nervenbahnen mit insgesamt 45 verschiedenen Rezeptorproteinen innerviert in einen zugehörigen Ballon. Untereinander sind die „Geruchsballons“ wiederum durch Neuronen verschaltet; über Projektionsneurone stehen sie in Verbindung mit höheren Hirnarealen – und sorgen so vielleicht dafür, dass der Geruch eines überreifen Apfels ein Bild vor dem inneren Facettenauge der Fliege entstehen lässt und ihr sozusagen „das Wasser im Rüssel zusammenlaufen lässt“. „Wir kennen all diese morphologischen Bausteine des Geruchssystems ziemlich gut“, sagt Hansson, „aber wir wissen nicht, was jeder im Detail macht.“ Um all das an den winzigen Fliegen untersuchen zu können, braucht Hanssons Team ein ganzes Arsenal an Mikroskopen.

Kaum ein Laborraum, in dem nicht eines dieser Hightech-Geräte steht. Wer durch die Labore wandert, dem fällt auf, dass diese Mikroskope nicht mehr viel mit einem herkömmlichen Schulmikroskop gemein haben. Die Zeiten der einfachen Lichtmikroskope sind lange vorbei; jedwede technische Möglichkeit wird genutzt, um das alte System auszureizen, die Auflösung zu erhöhen oder nur bestimmte Bereiche im Objekt sichtbar zu machen. Die Namen – konfokale LaserscanningMikroskope, Multi-Photonen-Laserscanning-Mikroskope, Fluoreszenz-Mikroskope oder Inverse Mikroskope – lassen nur erahnen, wie das gelingt.

NICHT ALLE MOLEKÜLE IM DUFT ZÜNDEN NEURONEN

Links und rechts von jedem Mikroskop-Arbeitsplatz türmen sich verschiedene Geräte. Bei einem bleibt Hansson stehen: „Das ist unsere Spezialität“, sagt er. Es handelt sich um einen GasChromatographen, ein Gerät, das einen Duft in seine molekularen Bestandteile zerlegt und analysiert. Das Ergebnis druckt der Chromatograph auf ein Papier als Duftkurve mit den Spitzenwerten für jeden einzelnen Bestandteil. Gleichzeitig bläst das Gerät die Duftmoleküle mit sanftem Luftstrom zielgerichtet zur Fliege. Wie die Fliegen, genauer gesagt ihre mit Rezeptoren bestückten Nervenzellen auf den Duft ansprechen, registrieren die Forscher unter dem Mikroskop in Echtzeit. Im Regal neben dem Mikroskoptisch stehen daher ein Bildschirm und ein Computer. „Wir kombinieren die Geruchsanalyse mit den neuronalen Aktivitätsspektren und lassen uns sozusagen von der Antenne erzählen, welche von den Hunderten Molekülen, die von einer Banane ausgesendet werden, bei der Fliege wirksam sind“, sagt Hansson.

Silke Sachse, Leiterin der Forschungsgruppe Optische Ableitung, sieht den Fliegen förmlich beim Riechen zu. Um von einem lebenden Tier von der Größe eines Apfelkerns überhaupt verwacklungsfreie Aufnahmen machen zu können, klemmt sie das Tier an einem drei Millimeter schmalen Kupferplättchen fest. Dabei schiebt sie den schmalen Bereich der Fliege zwischen Kopf und Brust – wie bei einer überdimensionalen Halskrause – in einen 0,1 Millimeter breiten Spalt des Plättchens. Den Kopf befestigt sie mit etwas Wachs. Das Tier muss absolut ruhig gestellt sein, damit die Mikroskopaufnahmen nicht verwackeln. Dann schiebt die MaxPlanck-Forscherin den Objektträger unter die Mikrokoplinse. Eine Videokamera nimmt das hundertbis vierhundertfach vergrößerte Bild auf, das man auf dem Monitor bequem betrachten kann.

MUTANTE ALS STRAHLENDES MUSTERBEISPIEL

Für ihre Untersuchung nutzt die Biologin eine Fliegenmutante, bei der man das Riechen in den Antennen, den Palpen und im Gehirn mit einem Farbstoff auf fast magische Weise sichtbar machen kann: „Diese trans gene Drosophila produziert einen fluo reszierenden Farbstoff, der alle olfaktorischen, sensorischen Neuronen anfärbt“, sagt Sachse. Unter normalem Licht ist nichts Besonderes zu erkennen. Doch sobald die Forscherin auf Fluoreszenz umschaltet, legt sich der Fensterausschnitt ins Dunkle und die Antennen und Palpen erstrahlen in Neongrün. „Wir können durch die Kutikula hindurch messen“, sagt Sachse. Der Farbstoff leuchtet so hell, dass er das hauchdünne Außenskelett der Riechkolben durchstrahlt. Das Riechhirn zu beobachten ist nicht ganz so einfach. „Dazu schneiden wir ein Fenster in die Kopfschale“, erklärt Sachse. Und das in Mikrometer-Dimensionen.

Das Gehirn von Drosophila ist etwas mehr als einen halben Millimeter groß, ein Antennallobus ein Zehntel Millimeter, ein Glomerulus noch zehnmal kleiner. „Das ist wirklich wahnsinnig klein.“ Auch nach vielen Jahren Forschung ist Silke Sachse immer noch beeindruckt von den Dimensionen, in denen sie arbeitet. Wenn es etwas zu riechen gibt, so strahlt auch das Riechhirn hellgrün. Doch der Farbstoff mit Namen Chamäleon kann noch mehr – er kann Veränderungen anzeigen: „Der Farbstoff bindet Calcium. Und je mehr Calcium er bindet, desto heller leuchtet der Antennallobus“, sagt Sachse. Je größer der Reiz an einer Nervenzelle ist, desto mehr Calcium-Ionen strömen in die Zelle ein. Je mehr Calcium einströmt, desto mehr bindet an den Farbstoff, desto heller leuchtet die Zelle im Fluoreszenzlicht auf.

GRÜNES WETTERLEUCHTEN ÜBER DEM RIECHHIRN

In der Filmaufnahme erinnert das Ganze an ein Wetterleuchten, das über das Riechhirn zieht: Hier ein kurzes Aufflackern, dort ein greller Schein, je nachdem, welches Duftmolekül die Antennen auffangen. Auf diese Weise erhält Sachse Aktivitätsmuster, die für jeden Geruch typisch sind und die sie den Spitzen in der Duftkurve zuordnen kann: „Ich sehe jetzt genau, wo welche Neuronen wie stark bei welchem Duft aktiv sind.“ Aus den kurzen Filmen schneidet sie einzelne Aufnahmen heraus und übersetzt die Aktivität in andere Farben: rot für starke, grün für mittlere und blau für keine Aktivität.

NEUER REZEPTORTYP IM FLIEGENRIECHORGAN GEFUNDEN

Während Silke Sachse das Geruchssystem der Fliege berührungslos beobachtet und analysiert, dringt ihr Kollege Dieter Wicher in noch kleinere Dimensionen vor. Er arbeitet sich bis an den Ort vor, an dem das Duftmolekül mit der Fliege Kontakt aufnimmt: die Geruchsrezeptoren in den Sensillen der Antenne. „Das ist besonders interessant, weil Insekten ja dafür bekannt sind, dass sie Duftstoffe in sehr geringen Konzentrationen wahrnehmen“, sagt Wicher. Die Taufliege benötigt nur zehn oder hundert Moleküle in einem Kubikzentimeter Luft, um Witterung aufzunehmen. „Das ist Millionen Mal empfindlicher als der menschliche Geruchssinn“, sagt Hansson: „Wir brauchen normalerweise einige hundert Millionen Moleküle und mehr, um etwas zu riechen.“

Einen Teil der Erklärung für die überaus sensiblen Nasen der Insekten liefern der Aufbau der Rezeptoren und die Art und Weise, wie sie das Signal „Duftmolekül angekommen“ vermitteln. Wicher und seine Kollegen identifizierten einen bisher unbekannten Rezeptortyp mittels der Patch-ClampMethode: Mit Pipetten, die als Elektroden dienen und deren fein polierte Spitzen einen Innendurchmesser von nur einem Hundertstel Millimeter haben – ein menschliches Haar ist fünf bis zehn Mal so dick –, messen die Forscher den durch einzelne Ionenkanäle fließenden Strom im Bereich von Billionstel Ampere direkt an der Nervenzelle. Die Ergebnisse präsentierten Hansson, Wicher und ihre Kollegen im April 2008 in NATURE.

Normalerweise überträgt der Rezeptor das Signal in einem mehrstufigen Prozess über sogenannte G-Proteine, die an der Innenseite der Zellmembran sitzen. Am Ende ergießt sich der Botenstoff cAMP (zyklisches Adenosinmonophosphat) in die Zelle. Dieser überträgt das Signal weiter an Ionenkanäle, die an anderer Stelle in der Membran sitzen. Das braucht aber eine gewisse Zeit. Die Kanäle öffnen sich, um schließlich mit Calcium-, Natriumund KaliumIonen ein elektrisches Potenzial aufzubauen. Von da aus gelangt die Information auf elektrischem Wege weiter bis ins Riechhirn.

IN DER KÜRZE LIEGT DIE WÜRZE – AUCH BEIM SCHNÜFFELN

Wicher und seine Kollegen fanden heraus, dass der Rezeptor und der Ionenkanal in der Membran der Insektenneurone direkte Nachbarn sind und nicht, wie bei uns, über die Membran verteilt liegen. Bei den Insekten bilden sie eine Einheit aus zwei Teilen, ein sogenanntes Dimer. „Dass es sich um ein Dimer handelt, wussten wir schon. Dass das zweite Protein aber der Ionenkanal ist, haben wir erst anhand unserer Messungen nachweisen können“, sagt Wicher. Die unmittelbare Nähe von Rezeptor und Kanal hat entscheidende Vorteile: Das Signal kann eine Abkürzung nehmen. Anstatt die lange Strecke über G-Protein und cAMP-Produktion zu nehmen, können sich Rezeptor und Ionenkanal kurzschließen. Das tun sie, wenn große Konzentrationen des Duftmoleküls den Rezeptor überschwemmen.

Ist die Duftspur aber nur schwach, schaltet der Rezeptor auf den klassisch biochemischen Weg über G-Protein und cAMP-Botenstoff um, der aber immer noch kürzer ist als in der Säugerzelle. „So ist die Reizweiterleitung bei Insekten viel empfindlicher als die olfaktorischen Rezeptoren anderer Tiere“, sagt Wicher. Noch haben die Forscher das System nicht ganz verstanden: Wie etwa sehen die Einzelschritte in der G-Protein-Signalkette aus? Was reguliert die Rezeptoren? Eines allerdings scheint klar zu sein: Das andere Design der Geruchsrezeptoren bei Insekten im Vergleich zu Säugerrezeptoren liefert einen Hinweis darauf, dass sich die beiden Geruchssysteme unabhängig voneinander entwickelt haben und nicht – wie bisher angenommen – den gleichen Ursprung besitzen. „Das ist offenbar wirklich eine Sonderanfertigung bei den Insekten“, sagt Wicher.

WAS IM DUFT DEN FLIEGEN BEINE MACHT

Hat die Fliege mit ihren so anders aufgebauten Rezeptoren einmal Witterung aufgenommen, kommt Hanssons Mitarbeiter Markus Knaden ins Spiel. Er braucht keines der vielen Mikroskope, die in den Laboren stehen. Er will nicht in die Fliegen hineinsehen, sondern das ganze Tier beobachten. Knaden studiert das Verhalten der Fliegen und damit das letzte Glied in der Kette des Geruchssystems von Drosophila. Die Fragen, die er beantworten will, sind eigentlich ganz einfache: Was macht die Fliege, wenn sie einen Geruch oder eine Geruchskomponente wahrnimmt? Folgt sie der Duftspur, flüchtet sie oder bleibt sie desinteressiert? Dass das gar nicht so einfach zu erforschen ist, wie man bei einem vermeintlich schlicht gestrickten Lebewesen wie einer Fliege vermuten könnte, erfuhr der Verhaltensökologe bei seinen ersten Versuchen.

ZEHN AUF EINEN STREICH IM WINDKANAL

Normalerweise gibt es eine Standardversuchsanordnung für solche Fragen. Die Fliege sitzt in einem Windkanal am Fuß einer Stange, auf die sie bei Bedarf klettern kann. Dann durchströmt ein Duft den Kanal, und man beobachtet, wie die Fliege reagiert. „Mit dieser Anordnung kann man aber immer nur ein einzelnes Tier untersuchen, was sehr zeitaufwändig ist, denn wir wollen ja eine Vielzahl von Geruchskomponenten an verschiedenen Individuen testen“, sagt Knaden. Deshalb ersann der Biologe eine Anlage, in der er zehn Fliegen gleichzeitig in parallelen Röhren untersuchen kann. Über ein ausgeklügeltes System kann er die Geruchsstoffe je nach Belieben zuführen. Das Verhalten zeichnet eine Kamera auf, um es später am Computer auszuwerten.

Auf dem Papier und als alles fertig aufgebaut war, sah es ganz wunderbar aus, nur: „Als wir dann zum ersten Mal die Fliegen in die Röhren setzten und die Duftstoffe einströmten, passierte gar nichts“, sagt der Verhaltensforscher, und man merkt ihm den Frust immer noch an. Knaden und seine beiden Mitarbeiter konnten machen, was sie wollten, die Labortiere verweigerten den Dienst. Jetzt muss er sich etwas Neues überlegen. Vielleicht doch wieder jedes Tier einzeln beobachten? Oder die Versuchsanordnung irgendwie verändern? Er weiß es noch nicht. Alles in allem hat ihn das Ganze von der Planung bis zu den ersten Versuchen bisher eineinhalb Jahre gekostet. Aber so läuft Forschung nun mal – es gibt keine Garantie für den Erfolg.

Auch Nobelpreisträger Adolf Butenandt und seine Mitarbeiter mussten zahllose Rückschläge hinnehmen, bis es ihnen seinerzeit gelang, die „sex attractive substances“ der Schmetterlinge zu isolieren. Alles Zeitverschwendung, wie die schockierte Dame befand? Tatsächlich war Butenandts Forschung bahnbrechend für das Verständnis des Geruchs. Und wer unbedingt einen Nutzen braucht, um Grundlagenforschung dieser Art zu rechtfertigen, bitte schön: Jede Borkenkäferfalle basiert heute letztlich auf der Geruchsforschung an Insekten. Die Fallen locken die Käfermännchen allerdings nicht zu ihrer Liebsten, sondern in den Tod.

KASTEN: EVOLUTION DES FLIEGENGERUCHS

Um herauszufinden, wie sich der Geruchssinn von Drosophila im Laufe der Evolution den unterschiedlichen Lebensbedingungen angepasst hat, verglich Bill Hanssons Team mehrere Drosophila-Arten. Aber „das Geruchssystem von Drosophila ist evolutionär betrachtet sehr konservativ“, sagt Hansson. Eigentlich hat es sich kaum verändert – nur bei einer Art war das dramatisch anders: In der Inselwelt im tropischen Klima der Seychellen nördlich von Madagaskar lebt eine besonders wählerische Fruchtfliege. Drosophila sechellia liebt die Noni, und nur die Noni. Die Fliege hat die Frucht des Indischen Maulbeerbaumes Morinda citrifolia nicht nur zum Fressen gern, sie legt auch ihre Eier darauf ab. „Die Frucht hat einen sehr speziellen Geruch“, findet Hansson, „eine Mischung aus Ananas und Gorgonzola.“ Der Käsegeruch ist ein Zeichen für einen hohen Säuregehalt. Dieser ist bei der gelben Noni-Frucht so hoch, dass Fliegen normalerweise daran sterben, wenn sie an ihr naschen.

Nicht so die Seychellen-Variante. Sie ist vollkommen auf die exotische Frucht eingestellt und hochgradig von ihr abhängig. „Die Abhängigkeit spiegelt sich in ihrem olfaktorischen System wider“, sagt Hansson. Die meisten Neurone in den Antennen sind auf die beiden Duftnoten des speziellen Noni-Geruchs geeicht. Gleichzeitig sind sie unglaublich sensibel. Sie nehmen den Noni-Duft noch wahr, wenn nur billionstel Milligramm in der Luft liegen. Selbst das Geruchshirn hat sich auf den Leckerbissen, der zugleich Kinderstube ist, eingestellt: Zwei der Glomeruli empfangen sämtliche Signale der Noni-Neuronen von der Antenne. „Und sie sind dreimal so groß wie die entsprechenden Glomeruli bei Drosophila melanogaster“, sagt Hansson. Während ihre Verwandten bei sehr hohen Duftkonzentrationen die Flucht ergreifen, kann Drosophila sechellia der gelben Frucht einfach nicht widerstehen.

MaxPlanckForschung, S. 25, 2, 2009

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